О Seplife ®Ионообменная хроматография

Как использовать смолы для ионообменной хроматографии?

1. Метод эксплуатации: 

Поскольку образец, буфер и элюент биохимического разделения являются подвижными фазами, их можно разделить при протекании через колонку. Поэтому ионный обмен можно выполнять в колоночной работе, а разделение — в хроматографической форме. В процессе разделения неадсорбированные вещества продолжают вытекать из реакционной системы, что заставляет равновесие непрерывно смещаться вправо, что является своего рода динамическим равновесием, поэтому его также называют динамической работой. Динамический режим работы имеет хороший эффект разделения, подходит для всех видов образцов и может реализовывать непрерывную работу. В операции хроматографического разделения условия загрузки хроматографической колонки оказывают определенное влияние на разделение. Смолы должны быть равномерно распределены в колонке, не допускается наличие пузырьков воздуха, а также следует предотвращать расслоение смол.

Для некоторых образцов с высокой вязкостью для предварительной экстракции и разделения можно использовать также метод «статической» обработки. Ионообменные смолы и обрабатываемую рабочую жидкость перемешивают в реакционном сосуде. После достижения адсорбционного равновесия разделяют смолы и рафинат и загружают их в колонку для элюирования.

Этот метод статической пакетной обработки имеет простое технологическое оборудование и легкую эксплуатацию. Например, предварительное разделение некоторых натуральных продуктов, таких как гепарин натрия, часто использует этот метод статической сепарации. 

При работе в режиме статического разделения скорость перемешивания ионообменника в рабочей жидкости должна надлежащим образом контролироваться. Если скорость перемешивания слишком высокая, а сила сдвига слишком большая, частицы ионообменника будут разрушены, и их будет трудно фильтровать и разделять; Если скорость слишком низкая, это повлияет на контакт между смолами и рабочей жидкостью, а также повлияет на скорость обмена.

2. Влияние образца на эффект разделения:

Для достижения высокого разрешения и высокой нагрузочной способности для биохимического разделения подготовка и производительность рабочего раствора также являются очень важными факторами. Вязкость и прозрачность рабочей жидкости не только влияют на эффект разделения ионообменных смол, но и влияют на срок службы разделительной среды.

Биохимическое разделение часто является относительно сложной системой, в которой присутствует множество видов примесей, не только малых молекул, но и некоторых коллоидных веществ, липидных веществ и т. д. В частности, некоторые необратимо адсорбированные макромолекулы могут покрывать функциональные группы среды или блокировать поры среды, вызывая необратимое загрязнение и сокращая срок службы разделительной среды. Поэтому перед операцией разделения рабочая жидкость должна быть как можно более тщательно подготовлена, чтобы обеспечить эффект разделения.

В процессе биохимического разделения и очистки часть целевых продуктов выносится в процессе элюирования, либо целевой продукт задерживается на среде из-за неполного элюирования, что приводит к потере продукта, что является важным фактором, влияющим на выход продукта.

В то же время структурные изменения в белке вызывают инактивацию, что также повлияет на выход. Добавление некоторых стабилизаторов или защитных агентов в процесс ионного обмена может не только увеличить выход, но и улучшить селективность разделительной среды для белков.

3. Влияние скорости потока на эффект разделения:

В ионообменном хроматографическом разделении скорость потока является важным фактором, влияющим на эффект разделения. Для получения превосходного эффекта разделения эксперименты должны проводиться на основе таких факторов, как тип ионообменной смолы, размер частиц и молекулярная структура активных ингредиентов в рабочей жидкости, чтобы установить лучшие экспериментальные параметры.

Если молекулярная масса целевого продукта относительно мала, а размер пор среды относительно велик, можно использовать более высокую скорость потока, поскольку это способствует массопереносу.

Однако, когда целевым продуктом является биомакромолекула, а размер пор среды меньше размера молекулы разделяемого вещества, следует использовать более медленную скорость потока из-за более медленной скорости диффузии молекулы.

При высокой вязкости рабочей жидкости следует также использовать меньшую скорость потока из-за меньшей скорости массопередачи.

Скорость потока влияет не только на эффект обменной адсорбции, но и на эффект элюирования. Обычно скорость потока во время элюирования медленнее, чем во время ионообменной адсорбции.

4. Методы элюирования ионообменной хроматографии:

Когда целевой белок в образце полностью связан с ионообменником, его следует элюировать. Основной принцип заключается в использовании иона или группы, которые более активны, чем адсорбирующее вещество, для десорбции целевого продукта, который обменивается и адсорбируется на внешней поверхности и внутренней части частицы среды. Различные целевые белки имеют разные способности связывания с ионообменными смолами. Поэтому следует выбрать подходящий элюент для элюирования белка из среды и сбора разделенных и очищенных продуктов. Существует примерно три метода элюирования для ионообменной хроматографии:

1) Одновременное элюирование: в качестве элюента используется одно и то же вещество, можно использовать разбавленную кислоту, щелочь или солевой раствор, либо подходящий органический растворитель, среди которых основным является солевой раствор, выбор которого осуществляется в зависимости от свойств целевого продукта и лекарственной формы конечного продукта. 

Поскольку адсорбированные вещества часто не одного типа, заряды, переносимые различными веществами, различны, и прочность связи со средой различна. Даже если используется один и тот же элюент, легко заменяемые вещества будут вытекать из среды первыми, и сила связи будет сильнее. После того, как вещества вытекают, при условии, что они собираются путем классификации, различные вещества можно разделить, чтобы получить относительно чистые продукты.

Этот метод чаще всего применяется для разделения, когда свойства целевого продукта хорошо известны, или для разделения аналитических видов.

2) Поэтапное элюирование: то есть элюирование осуществляется с использованием различных концентраций солевых растворов. В процессе обменной адсорбции разделительной среды адсорбируются различные белки. Если использовать постоянное условие элюирования, иногда не удается правильно разделить все компоненты, и необходимо изменить условие элюирования.

Изменение может быть поэтапным, то есть разные элюенты или элюенты с разными значениями pH выбираются для элюирования поэтапно, и разные пики элюирования могут быть получены в соответствии с разными концентрациями и разной кислотностью элюента. То есть, один вид концентрации соли может получить один вид целевого белка, а разная концентрация соли может получить разные целевые белки.

Этот пошаговый метод элюирования подходит для разделения белков с известными свойствами, особенно для крупномасштабного производства, и прост в эксплуатации и контроле.

3) Градиентное элюирование, то есть изменение ионной силы или значения pH элюента в соответствии с определенным линейным изменением (как правило, только в особых случаях используется метод элюирования изменением значения pH). При постепенной смене элюента можно заменять один за другим различные белки и получать различные белковые компоненты. 

В то же время белки, как правило, не имеют хвоста. Градиентное элюирование является наиболее часто используемым методом элюирования в ионообменной хроматографии, и это также метод элюирования с самой сильной элюирующей способностью, который подходит для элюирования компонентов со схожими зарядовыми свойствами.

В процессе элюирования можно использовать как прямоточное, так и противоточное элюирование. При прямоточном элюировании направление потока элюента совпадает с направлением потока рабочей жидкости. При противоточном элюировании, или обратном элюировании, направление потока элюента противоположно направлению потока рабочего раствора.

Если исходная жидкость обменивается и адсорбируется через обменную колонку сверху вниз, концентрация адсорбата в верхнем слое обменной колонки выше, чем в нижнем слое, и обратная десорбция элюента снизу вверх может более эффективно достичь цели элюирования. Однако, поскольку операция обратного элюирования намного сложнее, чем прямоточного элюирования, в настоящее время в основном используется прямоточное элюирование.

Дезинфекция ионообменных хроматографических смол:

В процессе получения некоторых биохимических продуктов с высокими требованиями к чистоте часто возникает необходимость в стерилизации разделительной среды для предотвращения попадания в целевой продукт примесей, таких как микроорганизмы.

Высокотемпературная дезинфекция является наиболее часто используемым методом. В настоящее время большинство ионообменников обладают стабильными физико-химическими свойствами и могут подвергаться высокотемпературной дезинфекции. Однако при использовании полисахаридных сред необходимо учитывать, что среда должна быть солевого типа, а высокотемпературная дезинфекция должна проводиться в нейтральных условиях, в противном случае это приведет к деградации полисахаридной макромолекулярной матрицы, что серьезно повлияет на срок службы среды.

NaOH также является хорошим дезинфицирующим средством. Однако соответствующую концентрацию NaOH следует выбирать в соответствии с щелочестойкостью среды, а также типом и степенью микробного загрязнения. При использовании дезинфекции NaOH можно также использовать замачивание колонки, то есть пропускать определенную концентрацию NaOH в колонку, закрывать клапан выпуска жидкости и замачивать в течение нескольких часов для достижения цели дезинфекции. Если NaOH использовать в сочетании с этанолом, можно получить лучшие результаты. При использовании дезинфекции NaOH можно совмещать дезинфекцию и CIP. 

Хранение ионообменных хроматографических смол:

Все виды хроматографических смол должны быть очищены перед хранением после использования. Это особенно важно для полисахаридных разделительных сред.

После использования разделительной среды промойте ее 2CV воды, а затем пропустите через колонку с 2 объемами слоя 20% этанола. Для сильнокислотной катионной среды SP промойте 20% раствором этанола, содержащим 0,2 моль/л ацетата натрия, а затем промойте дегазированным раствором этанола в воде при более медленной скорости потока.

После обработки его можно хранить при комнатной температуре или при 4-8°C в течение длительного времени. Хроматографическая колонка должна быть полностью герметизирована во время хранения, чтобы предотвратить испарение влаги и высыхание колонки.

Среду, которая не используется в данный момент, следует хранить в 20% растворе этанола. Все среды для ионообменного разделения следует хранить при температуре от 4°C до 30°C и защищать от замерзания.

Процесс разделения и очистки биологических макромолекул методом ионообменной хроматографии в основном основан на диссоциации различных молекул, чистом заряде ионов и электрической разнице в распределении поверхностного заряда для селективного разделения. Он стал одним из наиболее часто используемых методов очистки при разделении и очистке биохимических продуктов, белков, пептидов и других веществ.

Сеплайф ® Смолы для ионообменной хроматографии на основе декстрана:

Сеплайф ® декстрановые ионообменные хроматографические смолы используют декстрановую матрицу гель-фильтрационных хроматографических смол серии G (Seplife G-25 и Seplife G-50), а ионообменные функциональные лиганды с различными свойствами прочно связаны с поперечно-сшитой декстрановой матрицей.

Ионообменные смолы декстрана обычно хранятся в виде сухого порошка, который перед использованием необходимо набухнуть. Он широко используется в низкомолекулярных белках, таких как протромбин и низкомолекулярный гепарин.

Декстрановые ионообменные хроматографические смолы Sunresin:

DEAE Сеплайф ® А25/А50

Q Сеплайф ® А25/А50

CM Сеплайф ® С25/С50

SP Сеплайф ® С25/С50

Сеплайф ® Смолы для ионообменной хроматографии на основе сверхбыстрой проточной агарозы (BB):

Эта серия Seplife ® ионообменные хроматографические смолы готовятся путем связывания ионообменных лигандов с агарозными микросферами с размером частиц 100-300 мкм. Обратное давление относительно невелико при скорости потока. Для образцов с высокой вязкостью и мутностью использование этой серии смол может повысить эффективность.

Сверхбыстрые проточные агарозные ионообменные хроматографические смолы Sunresin:

DEAE Сеплайф ®  ВВ

Q Сеплайф ®  ВВ

CM Сеплайф ®  ВВ

SP Сеплайф ®  ВВ

Сеплайф ®  Смолы для ионообменной хроматографии на основе быстропроточной агарозы (FF):

Эта серия Seplife ®  Смолы используют агарозные микросферы размером 45-165 мкм в качестве матрицы, связываясь с различными функциональными группами. Подходящий диапазон размеров частиц позволяет использовать его в более широком диапазоне. Он широко используется на различных этапах улавливания, промежуточной очистки и полировки биологических продуктов.

Ионообменные хроматографические смолы Sunresin Fast Flow Agarose:

DEAE Сеплайф ®  ФФ

Q Сеплайф ®  ФФ

CM Сеплайф ®  ФФ

SP Сеплайф ®  ФФ

Сеплайф ®  Смолы для ионообменной хроматографии высокого разрешения на основе агарозы (HP):

В этой серии в качестве матрицы используются микросферы агарозы размером 25–45 мкм, полученные путем связывания различных функциональных групп.

Малый размер частиц позволяет смолам иметь более высокое разрешение, и они широко используются для тонкого разделения и подготовки небольших объемов образцов.

Агарозные ионообменные хроматографические смолы высокого разрешения Sunresin:

DEAE Сеплайф ®  л.с.

Q Сеплайф ®  л.с.

CM Сеплайф ®  л.с.

SP Сеплайф ®  л.с.

Агарозные ионообменные хроматографические смолы сверхвысокой емкости (XL): 

Специальная конструкция «щупальца» на агарозных микросферах снижает влияние стерических помех при связывании с биомолекулами, а лиганды распределяются более рационально, что обеспечивает сверхвысокую загрузку и высокую экономическую эффективность.

Агарозные ионообменные хроматографические смолы сверхвысокой емкости Sunresin:

DEAE Сеплайф ®  XL

Q Сеплайф ®  XL

CM Сеплайф ®  XL

SP Сеплайф ®  XL

Сеплайф ®  Агарозные ионообменные хроматографические смолы высокой жесткости (крупномасштабные):

Высокожесткая (крупномасштабная) агарозная ионообменная среда Sunresin имеет максимальное сопротивление давлению 0,5 МПа, максимальную скорость потока 1000 см3/ч и более высокую скорость массопереноса, что позволяет значительно повысить эффективность крупномасштабного производства.

В зависимости от размера частиц матрицы высокожесткая агарозная ионообменная среда Sunresin подразделяется на среду высокой жесткости + высокой скорости потока (Large Scale) и среду высокой жесткости + высокого разрешения (Large Scale HP). 

Агарозные ионообменные хроматографические смолы высокой жесткости Sunresin (крупномасштабные): 

DEAE Крупномасштабный / HP

Q Крупномасштабный / HP

CM Крупномасштабный / HP

SP Крупномасштабный / HP

Сеплайф ®  Полистирольные смолы для ионообменной хроматографии с однородным размером частиц (LXMS):

Сеплайф ® Смолы для ионообменной хроматографии типа IEX LXMS обеспечивают два вида размеров пор (50 нм, 150 нм) и три размера частиц (15, 30 и 50 мкм) полистирольных смол с однородным размером частиц. Их высокие свойства сшивания позволяют смолам выдерживать более высокое рабочее давление (3 МПа).

Два размера пор 50 нм и 150 нм подходят для захвата, промежуточной очистки и тонкой очистки антител, белков, пептидов, нуклеиновых кислот, антибиотиков, натуральных продуктов и других продуктов с различной молекулярной массой.

Смолы Sunresin™ для ионообменной хроматографии на основе полистирола с однородным размером частиц:

Сеплайф ®  LXMS 15Q/15S (размер частиц 15 мкм, размер пор 50 нм)

Сеплайф ®  LXMS 30Q/30S (размер частиц 30 мкм, размер пор 50 нм)

Сеплайф ®  LXMS 50Q/50S (размер частиц 50 мкм, размер пор 100 нм)

Сеплайф ®  LXMS 50HQ/50HS (размер частиц 50 мкм, размер пор 150 нм)

Сеплайф ®  Полиметилакрилатные ионообменные хроматографические смолы (LXPM):

Эта группа ионообменных хроматографических смол представляет собой микросферы с полиметакрилатом в качестве матрицы с использованием уникальной технологии синтеза полимеров Sunresin. Микросферы модифицированы с помощью точной технологии создания пор и поверхностных гидрофильных длинноцепочечных макромолекул, и связаны с различными ионообменными группами.

Благодаря хорошей гидрофильности, хорошей химической и физической стабильности и жесткой структуре, ионообменные хроматографические смолы обладают хорошей биосовместимостью и сроком службы, а также повышают эффективность очистки. Они охватывают применение на этапах производства и очистки, таких как захват, промежуточная очистка и тонкая очистка молекул, таких как антитела, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, антибиотики и натуральные продукты, и предоставляют клиентам комплексное решение для промышленного производства биологических образцов.

Полиметилакрилатные ионообменные хроматографические смолы Sunresin:

Сеплайф ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 650M (сильная гидрофильность, размер частиц 80 мкм) ）

Сеплайф ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 650S (сильная гидрофильность, размер частиц 50 мкм) ）

Сеплайф ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 706 (сильная гидрофобность ，сильный ионный мультимодальный, размер частиц 80 мкм ）

Сеплайф ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 5504 （сильная гидрофобность ，высокое разрешение, сильный ионный мультимодальный, размер частиц 80 мкм)

Для получения дополнительной информации о различных типах смол для ионообменной хроматографии свяжитесь с нами по адресу (info.lifescience@sunresin.com).