О компании Seplife ®Ионообменная хроматография

Как использовать ионообменные хроматографические смолы?

1. Способ выполнения операции: 

Поскольку образец, буфер и элюент при биохимическом разделении являются подвижными фазами, их разделение происходит в процессе прохождения через колонку. Следовательно, ионный обмен может осуществляться в режиме работы колонки, а разделение – в хроматографической форме. В процессе разделения неадсорбированные вещества продолжают вытекать из реакционной системы, что приводит к непрерывному смещению равновесия вправо, представляя собой своего рода динамическое равновесие, поэтому такой режим работы также называется динамическим. Динамический режим работы обеспечивает хороший эффект разделения, подходит для всех типов образцов и позволяет осуществлять непрерывную работу. В процессе хроматографического разделения условия загрузки хроматографической колонки оказывают определенное влияние на разделение. Смолы должны быть равномерно распределены в колонке, не должно быть пузырьков воздуха, а также следует предотвращать расслоение смол.

Для некоторых образцов с высокой вязкостью для предварительной экстракции и разделения можно также использовать метод «статической» обработки. Ионообменные смолы и обрабатываемая рабочая жидкость перемешиваются в реакционном сосуде. После достижения адсорбционного равновесия смолы и рафинат разделяют и загружают в колонку для элюирования.

Этот статический метод периодического действия отличается простым технологическим оборудованием и удобством в эксплуатации. Например, для предварительного разделения некоторых природных продуктов, таких как гепарин натрия, часто используется именно этот статический метод разделения. 

При работе в режиме статического разделения необходимо надлежащим образом контролировать скорость перемешивания ионообменника в рабочей жидкости. Если скорость перемешивания слишком высока, а сила сдвига слишком велика, частицы ионообменника разрушатся, и их будет трудно отфильтровать и разделить; если скорость слишком низка, это повлияет на контакт между смолами и рабочей жидкостью, а также на скорость обмена.

2. Влияние образца на эффект разделения:

Для достижения высокого разрешения и высокой нагрузочной способности при биохимическом разделении очень важны также подготовка и характеристики рабочего раствора. Вязкость и прозрачность рабочей жидкости влияют не только на эффективность разделения ионообменных смол, но и на срок службы разделительной среды.

Биохимическое разделение часто представляет собой относительно сложную систему, в которой присутствует множество примесей, не только мелких молекул, но и некоторых коллоидных веществ, липидных веществ и т. д. В частности, некоторые необратимо адсорбированные макромолекулы могут покрывать функциональные группы среды или блокировать поры среды, вызывая необратимое загрязнение и сокращая срок службы разделительной среды. Поэтому перед операцией разделения рабочую жидкость следует максимально тщательно подготовить для обеспечения эффективности разделения.

В процессе биохимического разделения и очистки часть целевых продуктов удаляется в процессе элюции, или же целевой продукт задерживается на среде из-за неполной элюции, что приводит к потере продукта, и это является важным фактором, влияющим на выход продукта.

В то же время структурные изменения в белке вызывают его инактивацию, что также влияет на выход продукта. Добавление стабилизаторов или защитных агентов в процессе ионного обмена может не только увеличить выход, но и улучшить селективность разделяющей среды по отношению к белкам.

3. Влияние скорости потока на эффект разделения:

В ионообменной хроматографии скорость потока является важным фактором, влияющим на эффективность разделения. Для достижения превосходного результата разделения следует проводить эксперименты с учетом таких факторов, как тип ионообменной смолы, размер частиц и молекулярная структура активных ингредиентов в рабочей жидкости, чтобы установить оптимальные экспериментальные параметры.

Если молекулярная масса целевого продукта относительно невелика, а размер пор среды относительно велик, можно использовать более высокую скорость потока, поскольку это способствует массопереносу.

Однако, если целевым продуктом является биомакромолекула, и размер пор среды меньше размера пор молекулы разделяемого вещества, следует использовать более низкую скорость потока из-за более низкой скорости диффузии молекулы.

При высокой вязкости рабочей жидкости следует также использовать меньший расход из-за более низкой скорости массопереноса.

Скорость потока влияет не только на эффект ионообменной адсорбции, но и на эффект элюирования. Обычно скорость потока во время элюирования ниже, чем во время ионообменной адсорбции.

4. Методы элюирования в ионообменной хроматографии:

Когда целевой белок в образце полностью связывается с ионообменником, его следует элюировать. Основной принцип заключается в использовании иона или группы, более активных, чем адсорбируемое вещество, для десорбции целевого продукта, который обменивается и адсорбируется на внешней поверхности и внутренней части частицы среды. Различные целевые белки обладают различной способностью связываться с ионообменными смолами. Поэтому следует выбрать подходящий элюент для элюирования белка из среды и сбора разделенных и очищенных продуктов. Существует примерно три метода элюирования в ионообменной хроматографии:

1) Одновременное элюирование: в качестве элюента используется то же самое вещество, и может применяться разбавленный раствор кислоты, щелочи или соли, либо подходящий органический растворитель, среди которых основным является солевой раствор, выбор которого осуществляется в зависимости от свойств целевого продукта и лекарственной формы конечного продукта. 

Поскольку адсорбированные вещества часто не относятся к одному типу, заряды, переносимые различными веществами, различны, и сила связывания со средой также различна. Даже при использовании одного и того же элюента легко замещаемые вещества будут вытекать из среды первыми, и сила связывания будет сильнее. После вытекания веществ, если их собрать методом классификации, можно разделить различные вещества и получить относительно чистые продукты.

Этот метод в основном используется для разделения, когда свойства целевого продукта хорошо известны, или для разделения аналитических типов.

2) Поэтапная элюция: то есть элюция проводится с использованием растворов солей различной концентрации. В процессе адсорбции в разделительной среде адсорбируются различные белки. При использовании постоянных условий элюции иногда не удается должным образом разделить все компоненты, и условия элюции необходимо изменять.

Изменение может быть поэтапным, то есть для элюирования поэтапно выбираются различные элюенты или элюенты с различными значениями pH, и в зависимости от концентрации и кислотности элюента могут быть получены различные пики элюции. Иными словами, одна концентрация соли позволяет получить определенный тип целевого белка, а разные концентрации соли позволяют получить разные целевые белки.

Этот пошаговый метод элюирования подходит для разделения белков с известными свойствами, особенно для крупномасштабного производства, и прост в эксплуатации и контроле.

3) Градиентная элюция, то есть изменение ионной силы или значения pH элюента в соответствии с определенным линейным изменением (как правило, метод элюции с изменением значения pH используется только в особых случаях). В процессе постепенного изменения элюента различные белки могут замещаться один за другим, и можно получить различные белковые компоненты. 

В то же время, белки, как правило, не имеют "хвоста". Градиентное элюирование — наиболее часто используемый метод элюирования в ионообменной хроматографии, а также метод элюирования с самой сильной элюирующей способностью, подходящий для элюирования компонентов со схожими зарядовыми свойствами.

В процессе элюирования могут использоваться как прямоточное, так и противоточное элюирование. При прямоточном элюировании направление потока элюента совпадает с направлением потока рабочей жидкости. При противоточном элюировании, или обратном элюировании, направление потока элюента противоположно направлению потока рабочего раствора.

Если исходная жидкость обменивается и адсорбируется через обменную колонку сверху вниз, концентрация адсорбата в верхнем слое обменной колонки выше, чем в нижнем, и обратная десорбция элюента снизу вверх позволяет более эффективно достичь цели элюирования. Однако, поскольку операция обратного элюирования значительно сложнее, чем операция прямоточного элюирования, в настоящее время чаще используется прямоточное элюирование.

Дезинфекция ионообменных хроматографических смол:

В процессе получения некоторых биохимических продуктов с высокими требованиями к чистоте часто требуется стерилизация разделительных сред для предотвращения попадания примесей, таких как микроорганизмы, в целевой продукт.

Высокотемпературная дезинфекция является наиболее распространенным методом. В настоящее время большинство ионообменников обладают стабильными физико-химическими свойствами и могут подвергаться высокотемпературной дезинфекции. Однако при использовании полисахаридных носителей необходимо учитывать, что носитель должен быть солевого типа, а высокотемпературная дезинфекция должна проводиться в нейтральных условиях, иначе это приведет к деградации макромолекулярной матрицы полисахаридов, что серьезно повлияет на срок службы носителя.

NaOH также является хорошим дезинфицирующим средством. Однако соответствующую концентрацию NaOH следует выбирать в зависимости от щелочестойкости среды, а также типа и степени микробного загрязнения. При использовании NaOH для дезинфекции можно также применять замачивание в колонке, то есть пропускать в колонку раствор NaOH определенной концентрации, закрывать выпускной клапан и замачивать в течение нескольких часов для достижения цели дезинфекции. При использовании NaOH в сочетании с этанолом можно получить лучшие результаты. При использовании NaOH для дезинфекции можно комбинировать дезинфекцию и CIP-очистку. 

Хранение ионообменных хроматографических смол:

Все виды хроматографических смол следует очищать перед хранением после использования. Это особенно важно для сред, используемых для разделения полисахаридов.

После использования разделительной среды промойте ее 2 объемами воды, а затем пропустите через колонку с 2 объемами слоя 20% этанола. Для сильнокислых катионных сред SP промойте 20% раствором этанола, содержащим 0,2 моль/л ацетата натрия, а затем промойте дегазированным этанольно-водным раствором при более низкой скорости потока.

После обработки его можно хранить при комнатной температуре или при температуре 4-8°C в течение длительного времени. Хроматографическая колонка должна быть полностью герметично закрыта во время хранения, чтобы предотвратить испарение влаги и высыхание колонки.

Неиспользуемый в данный момент носитель необходимо хранить в 20%-ном растворе этанола. Все ионообменные разделительные среды следует хранить при температуре от 4°C до 30°C и защищать от замерзания.

Процесс разделения и очистки биологических макромолекул методом ионообменной хроматографии в основном основан на диссоциации различных молекул, суммарном заряде ионов и электрической разности в распределении поверхностного заряда для селективного разделения. Он стал одним из наиболее часто используемых методов очистки при разделении и очистке биохимических продуктов, белков, пептидов и других веществ.

Сеплиф ®Смолы для ионообменной хроматографии на основе декстрана:

Сеплайф ®В ионообменных хроматографических смолах на основе декстрана используется декстрановая матрица, применяемая в гель-фильтрационных хроматографических смолах серии G (Seplife G-25 и Seplife G-50), а ионообменные функциональные лиганды с различными свойствами прочно связываются с сшитой декстрановой матрицей.

Ионообменные смолы на основе декстрана обычно хранятся в виде сухого порошка, который перед использованием необходимо набухнуть. Они широко используются в качестве заменителей низкомолекулярных белков, таких как протромбин и низкомолекулярный гепарин.

Хроматографические ионообменные смолы на основе декстрана от компании Sunresin:

DEAE Seplife ® A25/A50

Q Seplife ® A25/A50

CM Seplife ® C25/C50

СП Сеплиф ® C25/C50

Сеплиф ®Сверхбыстродействующие ионообменные хроматографические смолы на основе агарозы (BB):

Эта серия Seplife ®Смолы для ионообменной хроматографии получают путем связывания ионообменных лигандов с агарозными микросферами с размером частиц 100-300 мкм. Обратное давление при такой скорости потока относительно невелико. Для образцов с высокой вязкостью и мутностью использование этой серии смол может повысить эффективность.

Сверхбыстротекучие агарозные ионообменные хроматографические смолы Sunresin:

DEAE Seplife ®  ББ

Q Seplife ®  ББ

CM Seplife ®  ББ

СП Сеплиф ®  ББ

Сеплиф ®  Быстродействующие ионообменные хроматографические смолы на основе агарозы (FF):

Эта серия Seplife ®  В смолах в качестве матрицы используются микросферы агарозы размером 45-165 мкм, связывающиеся с различными функциональными группами. Подходящий диапазон размеров частиц позволяет использовать смолы в более широком диапазоне применений. Они широко применяются на различных этапах улавливания, промежуточной очистки и доочистки биологических продуктов.

Смолы для ионообменной хроматографии Fast Flow Agarose от компании Sunresin:

DEAE Seplife ®  FF

Q Seplife ®  FF

CM Seplife ®  FF

СП Сеплиф ®  FF

Сеплиф ®  Смолы для ионообменной хроматографии высокого разрешения на основе агарозы (HP):

В этой серии в качестве матрицы используются микросферы агарозы размером 25-45 мкм, полученные путем связывания различных функциональных групп.

Малый размер частиц позволяет смолам обеспечивать более высокое разрешение, что делает их широко используемыми для тонкого разделения и подготовки небольших объемов образцов.

Высокоразрешающие агарозные ионообменные хроматографические смолы Sunresin:

DEAE Seplife ®  HP

Q Seplife ®  HP

CM Seplife ®  HP

СП Сеплиф ®  HP

Сверхвысокоэффективные агарозные ионообменные хроматографические смолы (XL): 

Особая «щупальцеобразная» конструкция агарозных микросфер снижает влияние стерических препятствий при связывании с биомолекулами, а лиганды распределяются более равномерно, что обеспечивает сверхвысокую загрузку и очень экономичное решение.

Сверхвысокоэффективные агарозные ионообменные хроматографические смолы Sunresin:

DEAE Seplife ®  XL

Q Seplife ®  XL

CM Seplife ®  XL

СП Сеплиф ®  XL

Сеплиф ®  Высокожесткие агарозные ионообменные хроматографические смолы (для крупномасштабного производства):

Высокожесткая (для крупномасштабного производства) агарозная ионообменная среда Sunresin обладает максимальным сопротивлением давлению 0,5 МПа, максимальной скоростью потока 1000 см/ч и более высокой скоростью массопереноса, что позволяет значительно повысить эффективность при крупномасштабном производстве.

В зависимости от размера частиц матрицы, высокопрочная агарозная ионообменная среда Sunresin подразделяется на высокопрочную среду с высокой скоростью потока (Large Scale) и высокопрочную среду с высоким разрешением (Large Scale HP). 

Высокожесткие агарозные ионообменные хроматографические смолы Sunresin (для крупномасштабного производства): 

DEAE Large Scale /HP

Q Крупномасштабный /HP

CM Large Scale /HP

СП Крупномасштабный /HP

Сеплиф ®  Полистироловые ионообменные хроматографические смолы с однородным размером частиц (LXMS):

Сеплиф ®Ионообменные хроматографические смолы типа IEX LXMS обеспечивают два типа размеров пор (50 нм, 150 нм) и три размера частиц (15, 30 и 50 мкм) полистирола с равномерным размером частиц. Высокие сшивающие свойства позволяют смолам выдерживать более высокое рабочее давление (3 МПа).

Два размера пор — 50 нм и 150 нм — охватывают области применения для захвата, промежуточной и тонкой очистки антител, белков, пептидов, нуклеиновых кислот, антибиотиков, природных продуктов и других продуктов с различной молекулярной массой.

Полистироловые ионообменные хроматографические смолы Sunresin с равномерным размером частиц:

Сеплиф ®  LXMS 15Q/15S (размер частиц 15 мкм, размер пор 50 нм)

Сеплиф ®  LXMS 30Q/30S (размер частиц 30 мкм, размер пор 50 нм)

Сеплиф ®  LXMS 50Q/50S (размер частиц 50 мкм, размер пор 100 нм)

Сеплиф ®  LXMS 50HQ/50HS (размер частиц 50 мкм, размер пор 150 нм)

Сеплиф ®  Полиметилакрилатные ионообменные хроматографические смолы (LXPM):

Эта группа ионообменных хроматографических смол представляет собой микросферы с полиметакрилатом в качестве матрицы, полученные с помощью уникальной технологии синтеза полимеров компании Sunresin. Микросферы модифицированы с помощью точной технологии создания пор и гидрофильных длинноцепочечных макромолекул на поверхности, а также связаны с различными ионообменными группами.

Благодаря хорошей гидрофильности, высокой химической и физической стабильности и жесткой структуре, ионообменные хроматографические смолы обладают хорошей биосовместимостью и сроком службы, а также повышают эффективность очистки. Они охватывают этапы производства и очистки, такие как захват, промежуточная очистка и тонкая очистка молекул, таких как антитела, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, антибиотики и природные продукты, и предоставляют клиентам комплексное решение для промышленного производства биологических образцов.

Полиметилакрилатные ионообменные хроматографические смолы компании Sunresin:

Сеплиф ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 650M (высокая гидрофильность, размер частиц 80 мкм) ）

Сеплиф ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 650S (высокая гидрофильность, размер частиц 50 мкм) ）

Сеплиф ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 706 (сильная гидрофобность) ，сильный ионный многомодальный, размер частиц 80 мкм ）

Сеплиф ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 5504 （сильная гидрофобность ，высокое разрешение, сильная ионная многомодальная спектроскопия, размер частиц 80 мкм)

Для получения более подробной информации о различных типах ионообменных хроматографических смол, пожалуйста, свяжитесь с нами по адресу (info.lifescience@sunresin.com).