Выбор среды для ионообменной хроматографии

Процесс разделения и очистки биомакромолекул методом ионообменной хроматографии в основном осуществляется за счет использования диссоциационных свойств различных молекул, суммарного заряда ионов и электрической разницы распределения поверхностного заряда. Он стал одним из наиболее часто используемых методов очистки для разделения и очистки биохимических веществ, белков, пептидов и других субстанций.

В процессах разделения и очистки от компонентов колонна должна обладать высокой загрузочной способностью, простотой в эксплуатации и длительным сроком службы. Разделительная среда является наиболее важным фактором. Поэтому выбор разделительной среды имеет особое значение.
 

1. Выбор сортов:

Подходящий  среда для ионообменной хроматографии  Выбор среды разделения должен зависеть от типа заряда, размера молекулы, физико-химических свойств и микроокружения целевого продукта, подлежащего разделению и очистке. Для неорганических малых молекул выбор среды разделения относительно прост, но для биомакромолекул необходимо учитывать больше факторов.

Биомакромолекулы, такие как белки, состоят из множества аминокислот, которые проявляют различные электрические свойства при разных значениях pH, и биомакромолекулы предъявляют специфические требования к наиболее подходящей среде pH. Поэтому необходимо сначала понять электрическую точку целевого белка и соответствующую микросреду, и в соответствии с этими условиями выбрать подходящий вид ионообменника.

Выбор между катионообменником и анионообменником в основном зависит от заряда разделяемого материала при его стабильном pH. Если он положительно заряжен, выбирается катионообменник; если отрицательно заряжен, выбирается анионообменник. Например, изоэлектрическая точка разделяемого белка равна 4, а стабильный диапазон pH составляет 6-9. Поскольку в это время белок имеет отрицательный заряд, для разделения следует выбрать анионообменник.
 

2. Выбор скелета: 

Выбор подходящего матричного ионообменника должен основываться на выходе целевого продукта, требуемой чистоте и экономической целесообразности.

Полистироловая ионообменная смола общего назначения обладает такими характеристиками, как стабильная структура, низкая цена, высокая общая обменная емкость и подходит для экстракции и разделения распространенных биохимических продуктов, таких как антибиотики, органические кислоты, животные или растительные ресурсы. Однако для некоторых высокоценных продуктов генной инженерии, требующих высокой разрешающей способности и чистоты продукта, по-прежнему необходимы биохимические разделительные среды на основе целлюлозы, декстрана и агарозы.

Ионообменники на основе целлюлозы относительно недороги, но обладают низкой разрешающей способностью и стабильностью и подходят для первичного разделения и приготовления больших объемов раствора. Разрешение и цена ионообменника на основе декстрана умеренны, но он подвержен значительному внешнему воздействию, а объем может сильно изменяться при изменении ионной силы и pH, влияя на разрешение. Ионообменники на основе агарозы обладают хорошей механической стабильностью и высокой разрешающей способностью, но стоят дороже.

Идеальная среда для разделения должна не только легко адсорбироваться, но и легко элюироваться. Если целевой продукт не чувствителен к изменениям ионной силы и pH, можно рассмотреть сильную среду с сильным зарядом или сильную щелочность с высокой плотностью заряда. Если эти факторы чувствительны, следует использовать слабые или слабощелочные среды. Если адсорбируется макромолекулярное вещество, связь между ними относительно сильная, и элюирование часто затруднено. Если используются жесткие условия, вызывающие денатурацию макромолекул, следует выбрать среду с низкой плотностью функциональных групп.

Сильнокислая или сильнощелочная среда с широким диапазоном pH. Часто используется для разделения малых молекул или разделения при экстремальных значениях pH. Однако из-за своих сильных электрических свойств она иногда легко денатурирует или приводит к гибели некоторых чувствительных биомолекул. Слабокислые или слабощелочные среды обладают широким диапазоном селективности и нелегко инактивируют белки. Поэтому они, как правило, подходят для разделения макромолекул, таких как белки, но их диапазон pH узок.
 

3. Выбор размера частиц:

Размер разделяющей среды оказывает существенное влияние на разрешение и скорость потока в колонке ионообменной хроматографии. Как правило, разделяющая среда имеет малый размер частиц и высокое разрешение, но время достижения равновесия ионов велико, а скорость потока низкая; при большом размере частиц колонка имеет относительно высокую скорость потока и малое падение давления, но разрешение низкое, а загрузка мала. Поэтому разделяющая среда с крупными частицами подходит для крупномасштабного препаративного разделения, не требующего высокого разрешения, а разделяющая среда с мелкими частицами подходит для тонкого разделения, требующего высокого разрешения, или для стадии очистки продукта.