Ни Сеплайф ®6FF (IDA) Аффинная хроматографическая среда

Хроматографическая смола на основе никеля и агарозы

Ni Seplife 6FF (IDA) Инструкция

Ни Сеплайф ® 6FF (IDA) Аффинная хроматографическая среда Профиль продукта:

Хроматография на Ni-хелатирующей агарозе  (IDA) связывает иминодиуксусную кислоту на агарозной среде 6FF, а затем хелатирует ион Ni2+, чтобы быть в качестве  аффинная хроматографическая среда . Он широко используется для  переработка белка ,  нуклеиновая кислота  и  очистка полипептида  ниже по течению  биофарминг и биоинженерия .

Ни Сеплайф ® Параметры смолы для аффинной хроматографии 6FF (IDA):

Ни Сеплайф ® Инструкция по тестированию аффинной хроматографической среды 6FF (IDA):

1.Набивка колонны
(1) Все материалы и реагенты при комнатной температуре, приготовление исходного буфера и элюирования.
(2) Возьмите образец смолы в соответствии с размером колонки, промойте 20% этанолом досуха, используйте буфер (соотношение смолы : буфера = 3:1) для превращения в гомогенат и проведения дегазационной обработки.
(3) Используйте воду или буферный раствор для поддержания влажности внутренней части или дна колонки; уровень воды или буферного раствора должен быть выше мембраны фильтра, а дно колонки не должно быть пузырей.
(4) Используйте стеклянный стержень, чтобы направить гомогенат в колонку вместе с внутренней поверхностью колонки один раз, чтобы избежать пузырьков. Откройте выпускной клапан колонки, чтобы смола свободно осела, и хорошо подсоедините верхнюю крышку колонки.
(5)Откройте перистальтический насос, используйте буфер для пропускания через колонку со скоростью потока в 1,33 раза больше, чем скорость потока буфера при обычном использовании. Используйте буфер 2-3BV для балансировки колонки.
2.Равновесие
Уравновесьте с 2~5 объемами исходного буферного раствора до тех пор, пока проводимость, pH и другие параметры не изменятся.
3. Загрузка образца
(1) Образец обычно растворяется в исходном буфере с pH 6-8, а увеличение pH загрузочного буфера может увеличить загрузку.
(2) Буфер не должен содержать ЭДТА и цитрат, и лучше избегать таких восстановителей, как меркаптоэтанол и ДТТ.
(3) Обычно используемый буферный раствор содержит от 10 до 100 ммоль/л буферного раствора фосфата натрия и от 20 до 200 ммоль/л буферного раствора трис-HCl.
(4) Для устранения ионного обмена в буфер обычно добавляют 0,15–0,5 моль/л NaCl.
(5) При первом использовании геля агарозы с никелем-хелатом рекомендуется использовать в качестве начального буфера 50 ммоль/л PBS (50 ммоль/л NaH2PO4, 0,5 моль/л NaCl, pH 7,4).
4.Элюирование
Элюирование обычно подразделяется на следующие методы:
(1) Уменьшите pH элюирования: большинство белков будут элюироваться при pH 6-4 (также при pH 3-4), а буфером могут быть ацетат натрия, лимонная кислота и фосфатные буферные системы.
(2) Конкурентное элюирование: линейное увеличение или повышение концентрации конкурирующих веществ, имеющих сродство к ионам металлов (например, 0-0,5 моль/л имидазола, 0-50 ммоль/л гистидина, 0-2 моль/л NH4Cl).
(3)Элюирование хелатирующим агентом: хелатирующие агенты, такие как ЭДТА и ЭГТА, могут реагировать с ионами металлов, вызывая элюирование белка. Однако этот метод не может разделить различные белки и влияет на адсорбцию белков, что приводит к неспособности белка слияния зависать.

Ни Сеплайф ® 6FF (IDA) Аффинная хроматографическая среда Примечания:

(1)При первом использовании, если концентрация имидазола, необходимая для элюирования, неизвестна, рекомендуется добавить 10 ммоль/л, 20 ммоль/л, 50 ммоль/л, 100 ммоль/л, 200 ммоль/л, 500 ммоль/л в исходный буфер. Имидазол элюировался и собирался от низкого к высокому, соответственно, и результаты элюирования идентифицировались с помощью электрофореза SDS-PAGE.
(2)Имидазол является щелочным, и pH регулируется с помощью HCl после приготовления соответствующего буфера.
(3) Снижение pH элюирования и элюирование хелатирующего агента приведет к выпадению ионов металлов, и перед следующим использованием ионы металлов необходимо будет повторно хелатировать.
(4) Условно можно провести линейное элюирование градиентом имидазола для определения предпочтительных условий элюирования.
Для вышеуказанных методов элюирования в буфер необходимо добавить от 150 до 500 ммоль/л NaCl для устранения ионного обмена.
5.Регенерация
(1)Гель необходимо очистить и регенерировать после многократного использования или когда необходимо заменить хелатированные ионы металла. Метод удаления никеля: сначала промыть колонку 5–10 объемами слоя дистиллированной воды, затем промыть колонку 5–10 объемами слоя 100 ммоль/л ЭДТА и, наконец, использовать 2–3 объема слоя 0,5 моль/л NaCl для вымывания остаточного ЭДТА.
(2) Колонку, используемую многократно, обычно необходимо очищать после удаления никеля. Метод очистки: переверните колонку с 0,1~1,0 моль/л NaOH, поддерживайте ее при 50 см/ч в течение 1~2 часов, это не только может удалить сильные примеси, но и удалить источник тепла.
(3) Повторное хелатирование ионов металла после очистки. Метод хелатирования: во-первых, колонка после удаления никеля полностью уравновешивается 2–5 объемами слоя дистиллированной воды, а затем 0,1–0,3 моль/л раствора соли металла используется для пропускания 5–10 объемов слоя для хелатирования ионов металла. Промыть 5–10 объемами слоя дистиллированной воды для удаления нехелатированных ионов металла.
6.CIP
(1) Удаление белков, адсорбированных ионным обменом: 2–3 объема слоя промывали 2 моль/л раствором NaCl.
(2) Удаление сильных гидрофобных белков и липидов и т. д.: 4 объема слоя промывали 70% этанолом или 30% изопропанолом.
(3) Удаление осажденного белка, гидрофобного белка: этап регенерации контрольного геля.
7.Хранение
Герметично и хранится при температуре 4~30°C (20% этанола в растворе для хранения), в сухом, проветриваемом, чистом, не замороженном месте; использованные колонки хранятся в 20% растворе этанола при температуре 4~8°C.

Осторожность:
(1)Образец и Ni seplife ®6FF (IDA) необходимо уравновесить с элюирующим буфером, а затем направить на хроматографическую колонку.
(2) Основание колонны должно быть ровным, без углублений и воздушных пузырей, в противном случае его следует переустановить.
(3) При использовании убедитесь, что температура колонки и буфера одинакова, чтобы избежать образования пузырьков в слое колонки и влияния на эффект очистки.
(4) Скорость потока следует строго контролировать во время процесса элюирования и не делать ее слишком быстрой.
(5)Во время загрузки и всего процесса элюирования поверхность цилиндра не подвергается высыханию.