Элюция и регенерация

Когда хроматографическая среда исчерпана, ее следует элюировать. Основной принцип заключается в десорбции целевого продукта более активным ионом или группой. Различные сорбенты отличаются по своей активности. Поэтому для элюирования белка следует выбрать подходящий элюент.  хроматографические среды .

В ионообменной хроматографии существует примерно три способа элюирования:
Один из методов — одновременное элюирование. В качестве элюента может использоваться разбавленный раствор кислоты, щелочи или соли, а также подходящий органический растворитель, при этом в основном используется солевой раствор, а лекарственная форма выбирается в зависимости от природы целевого продукта и конечного продукта. Поскольку абсорбируемое вещество часто представляет собой не один вид, заряд каждого вещества различен, и сила связывания со средой также различна. Даже при использовании одного и того же элюента легко замещаемое вещество будет вытекать из среды первым, и сила связывания будет сильной. После удаления материала, его можно собрать методом фракционирования, разделив различные вещества для получения относительно чистого продукта. Этот метод часто используется для разделения, когда свойства целевого продукта хорошо изучены, или для разделения аналитических веществ.

Второй метод — ступенчатое элюирование, то есть элюирование с использованием растворов солей различной концентрации. В процессе адсорбции происходит адсорбция различных белков. При использовании постоянных условий элюирования иногда не удается должным образом разделить все компоненты, и возникает необходимость изменения условий элюирования. Это может быть ступенчатое изменение, то есть для элюирования поэтапно используются различные элюенты или элюенты с различными значениями pH, и в зависимости от концентрации элюентов и кислотности можно получить различные пики элюирования. То есть, при определенной концентрации соли можно получить целевой белок, а при различных концентрациях соли — разные целевые белки. Этот метод ступенчатого элюирования подходит для разделения белков известной природы, особенно для крупномасштабного производства, он прост в эксплуатации и управлении.

Третий тип — это непрерывное градиентное элюирование, то есть изменение ионной силы или pH элюата в соответствии с определенным линейным изменением (как правило, только в особых случаях используется метод элюирования, изменяющий pH), в процессе которого происходит градиентная элюция, при этом различные белки заменяются один за другим для получения различных белковых компонентов, и при этом белки, как правило, не подвергаются элюированию. Градиентное элюирование является наиболее распространенным методом элюирования в ионообменной хроматографии, а также методом элюирования с самой высокой элюирующей способностью, подходящим для элюирования компонентов со схожими зарядовыми свойствами.

В процессе элюирования может использоваться либо прямоточное, либо противоточное элюирование. Прямоточное элюирование также называется прямым элюированием, то есть направление потока элюента совпадает с направлением потока рабочей жидкости, а противоточное элюирование называется обратным элюированием, когда направление потока элюента противоположно направлению потока рабочей жидкости. Если исходная жидкость обменивается и адсорбируется сверху вниз через обменную колонну, концентрация адсорбата в верхнем слое обменной колонны выше, чем в нижнем слое, и обратная десорбция элюата снизу вверх позволяет более эффективно достичь цели элюирования. Однако, поскольку операция обратного элюирования намного сложнее, чем прямое элюирование, она в основном основана на положительном элюировании.

Скорость потока элюента также влияет на разделение в ионообменной хроматографии, и скорость элюирования обычно поддерживается постоянной. В целом, разрешение при медленном элюировании лучше, чем при быстром, но слишком низкая скорость элюирования приводит к увеличению времени разделения, побочным эффектам, таким как диффузия образца, расширение пиков спектра и снижение разрешения, поэтому выбор подходящей скорости элюирования зависит от конкретной ситуации. Если пики элюирования относительно сконцентрированы в определенной области и перекрываются, диапазон градиента следует соответствующим образом уменьшить или скорость элюирования следует снизить для повышения разрешения. Если разрешение хорошее, но пик элюирования слишком широкий, скорость элюирования следует соответствующим образом увеличить.